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    當(dāng)人們提到所謂的使能技術(shù)（enabling technologies），類(lèi)似印刷機(jī)的發(fā)明，或者**的發(fā)現(xiàn)就會(huì)浮現(xiàn)在我們腦海中。而對(duì)于科學(xué)家來(lái)說(shuō)，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)就是這樣一種系統(tǒng)。

    這種細(xì)菌免疫系統(tǒng)能通過(guò)將病毒DNA中的短重復(fù)片段整合到細(xì)菌基因組中，來(lái)抵抗病毒。當(dāng)細(xì)菌（或其后代）第二次感染病毒的時(shí)候，這些重復(fù)序列就能通過(guò)一種核酸酶靶向侵入的互補(bǔ)DNA,并摧毀它。

    2013年幾個(gè)研究組就利用了這一系統(tǒng)編輯真核生物基因，隨后看到在不少應(yīng)用中CRISPRs迅速崛起，多個(gè)不同物種都實(shí)現(xiàn)了基因組中基因刪除和插入，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄。但是隨著這一系統(tǒng)越來(lái)越受歡迎，關(guān)于其特異性和有效性的質(zhì)疑也越來(lái)越多。

    如何提高導(dǎo)向RNA（gRNA）的特異性是一大問(wèn)題，這種RNA能將Cas9 核酸酶帶領(lǐng)到基因組目標(biāo)位置，Nature Biotechnology雜志建議切斷gRNAs,減少脫靶問(wèn)題，而且不影響靶標(biāo)活性，而另外一個(gè)研究組則建議更長(zhǎng)一些的gRNAs （Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases）。

    這明顯是有些自相矛盾的建議，前者的研究人員指出只是簡(jiǎn)單截短了gRNA靶標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在之前檢測(cè)到的脫靶位點(diǎn)，脫靶突變都大幅減少，與全長(zhǎng)gRNA相比，一些位點(diǎn)的突變頻率甚至減少了5,000倍以上。重要的是在靶向它們的預(yù)定目標(biāo)DNA時(shí)，這些縮短了的gRNA（稱(chēng)為tru-gRNA）與全長(zhǎng)gRNA同樣有效。而后者則發(fā)現(xiàn)選擇合適的靶標(biāo)序列，優(yōu)化gRNA和Cas9,就能避免或者減少脫靶突變的出現(xiàn)。

    另外一個(gè)問(wèn)題是如何篩選脫靶，以及中對(duì)于研究的影響有多少?？梢则?yàn)證gRNAs錯(cuò)配候選位點(diǎn)的方法也許會(huì)錯(cuò)失一些關(guān)鍵的剪切位點(diǎn)，而且全基因組測(cè)序也不是非常有效，目前我們需要一種敏感且無(wú)偏差的方法，來(lái)標(biāo)記Cas9 靶標(biāo)位點(diǎn)，并令它們能在整個(gè)基因組中被識(shí)別出來(lái)。

    其它的令這一系統(tǒng)特異性更強(qiáng)的方法還有，用配對(duì)替換切口酶（nickases）替換Cas9 核酸酶（前者每次只能切斷DNA一條鏈），或者將 Cas9突變?nèi)诤系紽ok1 這種需要催化激活的核酸酶中去。此外，通過(guò)來(lái)自不同物種的Cas9也能增加靶向多個(gè)位點(diǎn)的靈活性，進(jìn)一步改善 Cas9-gRNA 復(fù)合物的傳遞系統(tǒng)，也有助于增加效率。

    盡管Cas9潛力無(wú)限，但是這還是一種細(xì)菌的蛋白，對(duì)于一些應(yīng)用，尤其是臨床上的應(yīng)用來(lái)說(shuō)，還需要尋找真核生物核酸酶進(jìn)行替換。對(duì)于植物來(lái)說(shuō)，一些Argonaute 核酸酶能通過(guò)小RNAs靶向DNA,這也是基因組編輯可以考慮的一個(gè)方向。

    原文檢索：

    Nicole Rusk. Next-generation CRISPRs. Nature Methods, 30 December 2014; doi:10.1038/nmeth.3237